LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA
PRAKTIKUM V
ISOLASI DNA
OLEH :
NAMA : ANDRI ADI GUNAWAN
STAMBUK : F1D1 13 049
KELOMPOK : II (DUA)
ASISTEN : ARTARINI OKTAVIANTI
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2014
I.
PENDAHULUAN
A.
Latar
Belakang
Makhluk hidup memiliki sifat yang akan diwariskan kepada
keturunannya. Suatu sifat yang menempati satu unit tertentu disebut dengan gen.
Gen tersebut akan menempati satu menempati posisi tertentu pada lokus pada
kromosom yang tersedia yang disebut dengan alel. Ilmu yang mempelajari tentang gen dan segala
aspeknya disebut genetika.
Asam
deoksiribonukleat atau yang lebih dikenal dengan DNA ialah suatu asam nukleat
yang menyimpan segala informasi biologis yang unik dan menyandi
instruksi-instruk genetik dari setiap makhluk hidup dan beberapa virus.
Struktur kimianya berupa makromolekul kompleks yang terdiri atas 3 macam molekul,
yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan basa nitrogen. DNA berada
di dalam suatu kromosom yang ada di dalam inti sel. Keberadaan DNA pada suatu
makhluk hidup dapat diketahui dengan cara mengisolasi DNA dari inti sel.
Isolasi
DNA merupakan suatu cara untuk memisahkan DNA dari organel-organel sel, protein
dan RNA sehingga diperoleh DNA murni dari suatu organisme. Molekul DNA ini
terdapat pada inti sel (nucleus),
mitokondria, dan kloroplas.Tahapan isolasi DNA pada organisme eukaryot yaitu isolasi
jaringan, pelisisan dinding dan membrane sel, pengekstraksian dalam larutan
buffer, presipitasi dan purifikasi DNA. Berdasarkan latar belakang
tersebut, maka dilaksanakan praktikum isolasi DNA.
B.
Rumusan
Masalah
Rumusan masalah pada praktikum isolasi DNA adalah bagaimana
cara mengisolasi DNA dari sumber jaringan?
C.
Tujuan
Penulisan
Tujuan yang ingin dicapai pada praktikum isolasi DNA adalah
untuk mengetahui cara mengisolasi DNA dari sumber jaringan.
D.
Manfaat
Penulisan
Manfaat dari praktikum praktikum isolasi DNA adalah dapat mengetahui cara
mengisolasi DNA dari sumber jaringan.
II.
TINJAUAN PUSTAKA
Darah merupakan cairan yang
bersirkulasi dalam tubuh manusia dan vertebrata yang berfungsi untuk
mengirimkan zat-zat dan oksigen yang dibutuhkan oleh jaringan tubuh, serta
mengangkut bahanbahan kimia hasil metabolisme, selain itu darah juga berfungsi
untuk pertahanan tubuh terhadap virus atau bakteri. Darah memiliki antigen dan
antibodi, dimana setiap masing-masing antigen dan antibodi terdiri dari A dan B
(Melati, 2011).
DNA memiliki struktur
pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula
pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA
terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. Sebuah sel memiliki DNA
yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem
kehidupan. DNA dapat diisolasi, baik dari sel hewan, manusia, maupun pada
tumbuhan (Faatih, 2009).
DNA berkualitas
tinggi yang akan didapat dalam suatu ekstraksi merupakan satu kaidah dasar yang
harus dipenuhi dalam studi molekuler. Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB) merupakan metode umum digunakan dalam
ekstraksi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan senyawa
polifenol. Ada tiga langkah utama dalam ekstraksi DNA, yaitu perusakan dinding
sel (lisis), pemisahan DNA dari bahan pada seperti protein dan pemurnian DNA
(Syafaruddin, 2011).
Analisa DNA
diawali dengan proses ekstraksi DNA. Tahapan dalam ekstraksi tersebut secara
umum meliputi isolasi dari jaringan, pelisisan dinding dan membran sel,
ekstraksi dalamlarutan, purifikasi serta presipitasi atau pemadatan. Ekstraksi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai metode, seperti metode fenol-kloroform dan
metode boom (Jehuda, 2012).
Ekstraksi untuk mendapatkan
DNA berkualitas tinggi merupakan satu kaidah dasar yang harus dipenuhi dalam
analisis molekuler karena kandungan senyawa sekunder dalam sel berbeda-beda,
maka setiap sel membutuhkan prosedur isolasi yang optimum agar diperoleh DNA
genom. Optimasi prosedur tersebut dapat dilakukan terhadap komposisi larutan
buffer lisisnya ataupun teknik penanganan fisik dalam pemisahan DNA genom dari
senyawa lain. Prinsip optimasi prosedur tersebut bertujuan melindungi DNA genom
dari degradasi akibat senyawa sekunder yang dilepaskan ketika sel dihancurkan
atau kerusakan akibat penanganan fisik (Restu, 2012).
III.
METODE
PRAKTIKUM
A.
Waktu
dan Tempat
Praktikum isolasi DNA dilaksanakan pada hari Minggu, 30
November 2014, pukul 09.30 – 17.30 WITA
dan bertempat di Laboratorium Genetika, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Halu Oleo, Kendari.
B.
Alat
dan Bahan
1.
Alat
Alat yang digunakan pada praktikum isolasi DNA dapat dilihat pada
Tabel 1.
Tabel 1. Nama
alat dan kegunaannya pada praktikum isolasi DNA
|
No.
|
Nama
Alat
|
Kegunaan
|
|
1.
|
Mikro pipet
|
Untuk mengambil larutan
|
|
2.
|
Eppendorf
|
Untuk wadah bahan pengamatan
|
|
3.
|
Mikro tube
|
Untuk wadah bahan pengamatan
|
|
4.
|
Elektroforesis
|
Untuk membantu migrasi DNA
|
|
5.
|
Sentrifuga
|
Untuk mengendapkan DNA
|
|
6.
|
Foto dyne
|
Sebagai sumber cahaya UV
|
|
7.
|
Kamera
|
Untuk mendokumentasikan hasil pengamatan
|
|
8.
|
Spatula plastik
|
Untuk memindahkan agaros
|
|
9.
|
Waterbath
|
Untuk alat inkubasi
|
|
10.
|
Kulkas
|
Untuk alat inkubasi
|
|
11.
|
Cawan porselin
|
Untuk menggerus jaringan
|
|
12.
|
Alat tulis
|
Untuk mencatat tahap isolasi DNA
|
|
13.
|
Bak agaros
|
Untuk wadah agaros
|
|
14.
|
Enlenmeyer
|
Untukwadah larutan agaros
|
|
15.
|
Timbangan
|
Untuk menghitung berat larutan
|
|
16.
|
Tip
|
Untuk membantu dalam pengambilan larutan
|
|
17.
|
Cutter
|
Untuk memotong jaringan katak
|
|
18.
|
Hot plate
|
Untuk memanaskan larutan agaros
|
|
19.
|
Spatula besi
|
Untuk memindahkan bahan ke dalam eppendorf
|
|
20.
|
Gunting
|
Untuk menggunting
sayap lebah dan menggunting isolasi bening
|
|
21.
|
Botol plastik
|
Untuk tempat penyimpanan hewan
|
2.
Bahan
Bahan yang digunakan pada praktikum isolasi DNA dapat dilihat
pada Tabel 2.
Tabel 2. Nama
bahan dan kegunaannya pada isolasi DNA
|
No.
|
Nama
Bahan
|
Kegunaan
|
|
1.
|
Jaringan otot
|
Sebagai sumber DNA
|
|
2.
|
Jaringan darah
|
Sebagai sumber DNA
|
|
3.
|
Katak
|
Sebagai sumber DNA
|
|
4.
|
Lebah
|
Sebagai sumber DNA
|
|
5.
|
Lebah hitam
|
Sebagai sumber DNA
|
|
6.
|
Buffer CTAB
|
Menghancurkan
membran sel
|
|
7.
|
Kloroform
|
Sebagai mendenaturai komponen protein
|
|
8.
|
Amonium asetat + Isopropanol
|
Sebagai penngikat air dan larutan lain sehingga DNA berdiri sendiri
|
|
9.
|
Isolasi bening
|
Sebagai pemembuat dinding bak
agaros
|
|
10.
|
Larutan etanol 70%
|
Sebagai pembersih sisa Amonium asetat + Isopropanol
|
|
11.
|
Larutan TE
|
Sebagai larutan penyangga DNA
|
|
12.
|
Larutan EtBr
|
Membantu
pewarnaan DNA
|
|
13.
|
Larutan Loading dye
|
Sebagai pemberat DNA
|
|
14.
|
Agaros
|
Sebagai media DNA
|
|
15.
|
Air
|
Sebagai bahan pengamatan
|
|
16.
|
Tissue
|
Sebagai bahan pengamatan
|
|
17.
|
Kapas
|
Sebagai mengambil kloroform
|
|
18.
|
Aluminium foil
|
Sebagai penutup mulut enlenmeyer
|
|
19.
|
Handscun
|
Sebagai pelindungi tangan dari bahan karsinogen
|
|
20.
|
Masker
|
Untuk menghindari menghirup bahan-bahan
kimia
|
|
21.
|
Gabus dan karet busa
|
Sebagai penyangga eppendorf dan mikro tube
|
C.
Prosedur
Kerja
Prosedur kerja pada praktikum isolasi DNA adalah sebagai
berikut.
1.
Mempersiapkan bahan pengamatan berupa katak dan serangga.
2.
Mengambil jaringan pengangkut pada serangga dengan cara
menggerus serangga. Mengambil sel darah merah pada katak (Rana Sp.) dengan cara menusuk pada bagian jantungnya, kemudian
jaringan pegangkut dan sel darah merah disimpan di tabung eppendorf.
3.
Menghitung berat awal jaringan pengangkut pada serangga dan
sel darah merah pada katak.
4.
Menambahkan larutan buffer CTAB sebanyak 5 tetes.
5.
Menginkubasi dalam waterbath pada suhu 550C,
kemudian menginfersi sampel 4 kali selama 2 jam tiap 30 menit. Terjadi
penggumpalan pada sel darah merah pada katak setelah di inkubasi.
6.
Mengambil sampel DNA, kemudian menambahkan kloroform dan
campur dengan cara menggoyang-goyangkan tabung dengan pelan.
7.
Centrifuge selama 12 menit pada 145.000 rpm dengan suhu 80C.
8.
Transfer fase cair ke dalam tabung eppendorf baru.
9.
Menambahkan amonium asetat.
10. Menambahkan isopropanol.
11. Menginkubasi selama 40
menit.
12. Centifuge selama 12 menit
pada 145.000 rpm dengan suhu 80C.
13. Membuang supernatan.
14. Menambahkan etanol, kemudian
membolak-balik tabung.
15. Centrifuge selama 3 menit
pada 145.000 rpm dengan suhu 120C.
16. Buang supernatan.
17. Menambahkan larutan TE
sebanyak 60 ul.
18. Mendiamkan selama 2 jam.
19. Pembuatan agarose :
a.
Memanaskan agarose sambil di aduk sampai meleleh.
b.
Menambahkan ETBr sebanyak 7,5 ul ke dalam agarose.
c.
Simpan dalam wadah, kemudian diamkan sampai menjadi gel.
d.
Setelah menjadi gel, simpan agarose pada bak elektroforesis
kemudian tambakan larutan TAE.
20. Setelah sampel DNA didiamkan
selama 2 jam, ditambahakn loading dye
dalam media plastik. Kemudian sampel DNA dicampur ke dalam loading dye agar homogen.
21. Setelah itu mengambil sampel
DNA dan loading dye yang sudah
homogen, kemudian menyimpannya ke dalam bak elektroforesis yang berisi agarose.
22. Mengelektroforesis selama 30
menit.
23. Setelah itu melihat sampel
DNA dengan menggunakan fotophoresis.
24. Mengamati foto hasil pengamatan
IV.
HASIL
DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Pengamatan
Hasil
pengamatan pada praktikum isolasi DNA adalah sebagai berikut.
Tabel 3. Hasil pengamatan
pada praktikum isolasi DNA
|
No.
|
Gambar pengamatan
|
Keterangan
|
||
|
1.
|
Hasil elektro foresis sampel jaringan pada serangga lebah (Apis cerana)
|
1.
Sampel (pita DNA)
2.
Pengotor pada pita DNA
|
||
|
2.
|
Hasil elektro foresis sampel sel darah merah katak (Rana sp.)
|
1.
Sampel (pita DNA)
2.
Pengotor pada pita DNA
|
B. Pembahasan
DNA adalah asam nukleat yang mengandung informasi biologis dan instruksi-instruksi
genetika dari setiap makhluk hidup dan beberapa berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA memiliki
struktur pilinan utas ganda yang anti parallel dengan komponen-komponennya,
yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh
sistem kehidupan.
Berdasakan hasil pengamatan yang telah dilakukan, diketahui
tahapan dalam melakukan isolasi DNA. Tahapan pengisolasian diawali dengan
mengambil bahan yang akan diisolasi DNAnya dan disimpan dalam tabung eppendorf.
Kemudian menghitung berat awal jaringan dan menambahkan larutan buffer CTAB.
Setelah itu, menginkubasi dalam water bath pada suhu 55oC selama 2
jam. Kemudian, mengambil sampel DNA dan menambahkan kloroform. Tahapan
selanjutnya ialah menyentrifuge selama 12 menit pada 145000 rpm dengan suhu 8oC.
Kemudian, mentrasferkan fase cair ke dalam tabung eppedorf baru dan emnambahkan
amonium asetat dan isopropanol. Setelah itu, menginkubasi selama 40 menit dan
menyetrifuge selama 12 menit pada 145000 rpm dengan suhu 8oC. Tahapan
selanjutnya ialah membuang supernatan dan menambahkan etanol. Kemudian
melakukan centrifuge selama 3 menit pada 145000 rpm dengan suhu 12oC
dan membuang supernatant. Tahapan selanjutnya ialah menambahkan TE sebanyak 60
ul dan mendiamkan selama 2 jam. Setalah itu, sampel DNA dihomogenkan dengan loading dye dan sampel disimpan dalam
bak eletroforesis. Kemudian melakukan elektroforesis selama 30 menit. Tahapan
selanjutnya ialah melihat sampel DNA dengan menggunakan fotophoresis dan
mengamati foto hasil pengamatan.
Larutan
yang digunakan dalam melakukan isolasi DNA, yaitu CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) yang merupakan deterjen yang
memiliki fungsi melisiskan membran plasma sel dan menjadi buffer yang mana
membentuk komplek dengan DNA, kloroform yang memiliki kegunaan untuk
mendenaturasikan dan memisahkan protein dari DNA, isopropanol yang memiliki prinsip
kerja sebagai larutan yang akan mengendapkan (presipitasi) DNA dengan melakukan
metode sentrifugasi, amonium asetat yang memiliki fungsi sebagai pengstabil
sampel DNA pada saat presipitasi, etanol yang memiliki fungsi sebagai larutan
pencuci setelah presipitasi, buffer TE (Tris-EDTA) memiliki kegunaan sebagai
pengstabil yang mana menjaga DNA agar tidak mudah rusak dan melarutkan DNA yang
dihasilkan, larutan TAE (tris acetate EDTA) yang memiliki kegunaan sebagai
buffer dan penghantar listrik yang baik pada saat elektroforesis yang mana, dan
Etidium Bromide (EtBr) yang memiliki fungsi untuk mengikat DNA dan menyebabkan
DNA yang ada pada gel agarose dapat
berpendar saat disinari sinar UV.
Hasil
pengamatan pada praktikum isolasi DNA memperlihatkan hasil elektroforesis yang
diamati menggunakan gel doc dengan bantuan sinar uv. Hasil tersebut
memperlihatkan sampel atau pita DNA dengan pengotor pada pita DNA. Pengotor
tersebut dapat berasal dari komponen protein, RNA (Ribonucleic acid) atau kotoran saat penggerusan. Hasil isolasi pada
sampel darah memperlihatkan pengotor pita DNA yang lebih sedikit dibandingkan
dengan sampel serangga. Hal tersebut dapat terjadi akibat kurang baiknya
penggerusan jaringan dan tekstur awal sampel serangga yang lebih kasar
dibandingkan sampel darah.
V.
PENUTUP
A.
Kesimpulan
Kesimpulan dari praktikum isolasi DNA
adalah mengambil jaringan hewan kemudian memasukkannya ketabung
eppendorf.Memberikan larutan pelisis dinding sel berupa CTAB
kemudian mensentrigusasi untuk memisahkan DNA dan bagian sel berdasarkan massanya.Pengekstraksian
DNA dilakukan dengan memasukkan larutan berupa kloroform, ammonium asetat,
isopropanol dilakukan dengan memasukkan eppendorf berisi DNA ke waterbath,
disentrifugasi, dan diinkubasi untuk mendapatkan ekstrak DNA. Presipitasi DNA dilakukan
dengan memindahkan pellet DNA ke tabung eppendorf yang baru untuk tambahkan
aquabidest 9(dH2O) dan TE untuk disiapkan agar diamati melalui
elektrofotoresis.
B.
Saran
Saran pada praktikum isolasi DNA adalah
sebagai berikut.
1.
Diharapkan kerja
sama antara praktikan dalam melakaukan praktikum agar pengamatan terlaksanan
dengan lancar
2.
Diharapkan
perhatian dan pengawasan asisten terhadap praktikan agar tak ada praktikan yang
tidak aktif dalam melakukan pengamatan.
DAFTAR
PUSTAKA
Faatih,
M., 2009, Isolasi dan Digesti Dna
Kromosom, J. Penelitian Sains dan
Teknologi, 10 (1) : 61-67
Jehuda, V., 2012, Ekstraksi DNA dari Sperma pada
Kondom dan Kain yang Tersimpan Sampai Dua Belas Hari, J. Simbiosis, 1 (1) : 28-39
Melati, E., Passarella, R., Primartha, R., dan
Murdiansyah, A., 2011, Desain dan Pembuatan Alat Pendeteksi Golongan Darah
Menggunakan Mikrokontroler, J. Generic,
6 (2) : 48 – 54
Restu, M., Mukrimin dan Gusmiaty, 2012, Optimalisasi
Teknik Ekstraksi dan Isolasi DNA Tanaman Suren (Toona Sureni Merr.)
untuk Analisis Keragaman Genetik berdasarkanRandom Amplified Polymorphic DNA
(RAPD), J. Natur Indonesia, 14
(2) : 138-142
Syafaruddin
dan Santoso, T.J., 2011, Optimasi
Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA yang Efisien dan Efektif pada Kemiri Sunan (Reutalis
Trisperma (Blanco) Airy Shaw), J. Littri, 17 (1) : 11-17
Tidak ada komentar:
Posting Komentar